southern blot （dna印迹） whatman 3mm滤纸应用
实验目的】 掌握dna印迹技术的基本原理，学习dna印迹技术的操作方法，了解dna印迹技术的应用范围。
【实验原理】
dna印迹是1975年由英国southern创建的。其基本原理是：dna分子经限制性核酸内切酶酶切后，由琼脂糖凝胶电泳将所得dna片段按分子质量大小分离，然后将dna片段变性，并使凝胶中的单链dna片段转移到尼龙膜、硝酸纤维素膜(nc)或其他固相支持物上，此法中dna片段由液流携带通过虹吸作用由下向上抽吸，从凝胶转移印至滤膜表面。然后与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应，用放射性自显影或酶反应显色来鉴定待测dna分子。
dna印迹技术主要用于对基因组dna的定性和定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性(rflp)等。
【实验对象】
待测dna。
【试剂与器材】
(1) 水平电泳装置，电泳仪，紫外灯，摇床。
(2)待测dna，琼脂糖，溴化乙啶，dna探针，保鲜膜，缓冲液。
(3) 0.25 mol/l hcl
(4) 变性液：1.5 mol/l nacl; 0.5 mol/l naoh(保存于室温)。
(5) 中和液： (ph 7.0) 5 mol/l nacl; 0.5 mol/ltris-hci (保存于室温)。
(6) 转移液 (20×ssc ph 7.0)：用800 ml h2o溶解175.3 gnacl和88.2 g柠檬酸钠，以浓 hci调ph至7.0，用双蒸水定容至1 l。分装后高压**。
(7) 2×ssc。
(8) 尼龙膜或硝酸纤维素 (nc) 膜。
【实验方法与步骤】
(1) 取适量已酶切充分的待测dna (1 μg左右)，于0.8%~1.25％的琼脂糖凝胶上与合适的 dna分子量标准一同进行稳压电泳。
(2) 切去凝胶一角以标记方向，用溴化乙啶染色后拍照记录电泳结果(拍照时，凝胶旁放一尺子，便于以后对照电泳带在膜上的位置) ，再切下一侧dna分子量标准带。
(3) 处理凝胶以备转膜。
1) 蒸馏水短暂漂洗凝胶(轻摇)。
2) 将凝胶浸没入10倍于凝胶体积(约30min)的0.25mol/lhcl溶液中15~30min，使dna脱嘌呤。蒸馏水短暂漂洗凝胶2次。
3)将凝胶浸没入10倍体积的变性液中20min，2次，蒸馏水漂洗2次。
4) 将凝胶浸没入10倍体积的中和液中20min，2次，使变性液被中和。
(4) 在制备杂交用胶时准备转移的平台、膜、滤纸等。
(5) 安装虹吸转移装置：如图25-3所示，将一固体支持物置于盛有足以浸没其一半高度的20×ssc的平皿中，依次将1张whatman 3 mm滤纸桥，3张whatman 3 mm滤纸，凝胶，叠放于固体支持物上，用塑料薄膜包裹凝胶边缘后，将1张在蒸馏水中平衡过的尼龙膜(或用蒸馏水浸湿，然后在20×ssc中平衡10min的nc膜)，5张whatman3mm滤纸及一叠4cm纸巾塔依次置于凝胶的上部，再放一玻璃板，其上压重物(注意：凝胶与转印膜间应避免有气泡，滤纸、吸水纸巾等必须大小一致)。转移持续4h以上或过夜，勿使转移液干枯。
(6)使已转移的dna与膜交联：取出转印膜，用铅笔在膜上标记样品孔的位置，并切去一角以标示方向。用2×ssc漂洗转印膜，然后将其放在一张whatman3mm滤纸上，有dna的一面朝上，使其完全干燥。再将膜置于uvcrosslinker中，在紫外光下自动交联或将nc转印膜置于可透过紫外线的塑料夹层中，带有dna的一面朝下，置于紫外透射仪(波长在254nm)上，以合适的照射强度进行紫外线交联，以固定dna。
(7) 用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜后，将其夹于2张whatman 3mm滤纸之间，80℃真空干烤2h或空气干燥。转印膜干燥后可夹在2张whatman3mm滤纸之间，室温下放置数月。备做核酸杂交实验。
southernblot仅仅是将待测dna片段从电泳凝胶中转移并固定到固相支持物上，要实现dna探测还需完成核酸杂交实验（包括探针标记、杂交和检测三个后续实验步骤）。杂交的双方是待测核酸序列和探针，二者按碱基互补原则退火形成双链。探针是用于检测的已知核酸片段，根据标记物的不同可分为放射性(同位素)标记探针和非放射性(非同位素)标记探针。放射性标记的探针，是在探针制备过程中掺入32p-dntp而实现放射性标记的。非同位素标记物有生物素(biotin)、地高辛(dig-oxigenin，dig)和荧光素(fluorescein)等。待测核酸与探针杂交后，通过放射自显影、化学显色或直接在(荧光)显微镜下观察杂交信号来鉴定待测核酸分子的大小及含量(方法见第六节后附录一和附录二)。
【注意事项】
(1)在分辨核酸电泳带所需的凝胶浓度范围内，电泳中使用的琼脂糖凝胶的浓度越低越好，并且厚度应 ≤7mm。转印前切去凝胶多余的边缘，因为凝胶边缘多比凝胶本身要厚，与滤膜很难紧密相贴。
(2)电泳结束后，应在紫外检测仪下仔细观察酶切是否完全、电泳分离效果是否良好、dna样品有无降解、样品量是否一致、是否有因电场强度不均匀导致样品带泳动速度不一致等。
(3)戴手套以防手受酸碱溶液损伤，同时避免污染滤膜。取拿滤膜时使用平头镊子。
(4)在转移过程中，如吸水纸巾全部润湿需及时更换，否则会造成缓冲液的逆流。
(5) dna片段的大小决定其转移速度。小于1kb的dna片段，1h即可完成转移过程。大片段dna的转移速度和效率则慢得多，如大于15kb的dna片段需要18h以上。因此，当dna片段长度大于15kb时需进行脱嘌呤(稀盐酸)及强碱水解处理，使之降解成较小的片段，从而提高转移效率。