朱靖蓉1，王忠民2，李瑾瑜1，马兴旺3
（1 新疆农业大学食品科学学院，乌鲁木齐 830052；2 新疆食品药品监督管理局，乌鲁木齐 830002；
3 新疆农业科学院，乌鲁木齐 830091）
摘 要：本文以脱脂葡萄籽为原料从中提取原花青素，研究用大孔吸附树脂对原花青素分级纯化方法，以及纯化的原花青素产品**超氧阴离子自由基、亚油酸体系的抗氧化等方面的抗氧化活性。结果显示：ads-8大孔树脂对葡萄籽原花青素具有较强的吸附能力，得到的产物纯度达95％以上，是分离葡萄籽原花青素较理想的吸附剂；20％和40％的乙醇原花青素洗脱液具有很强的**o2-·的能力，抑制邻苯三酚自氧化率分别达88.35％和67.2％，说明葡萄籽原花青素为抗自由基的有效活性成分；在亚油酸体系中，opc’s的抗氧化能力高于vc和ve。
关键词：葡萄籽；原花青素；大孔吸附树脂；自由基
原花青素是迄今为止所发现的*有效的自由基**剂之一，它对近70多种**具有直接或间接的预防**作用，具有广泛的生化和药理活性，在医药、化妆品及保健食品等领域具有广泛的用途［1］。原花青素广泛存在于各种植物（如葡萄、银杏、白桦树、可可豆等）的核、皮或种籽中，大多数原花青素产品从各种植物中提取，但多数的原花青素含量比较低。目前普遍认为葡萄籽是提取原花青素的较好来源［2，3］，但葡萄籽提取物是多酚（polypheno1）类黄酮，由单体（儿茶素、表儿茶素等）、基于此单体的聚合物（原花青素proanthocyanidln）和其它酚类组成。这一组成分中生物活性*强的部分是低聚（二，三聚体）原花青素，即opcs（oligomericproanthocyaniditns)［4］。在葡萄籽提取物中opcs含量高低就成为产品质量的*关键指标。葡萄籽粗提物中原花青素含量较低，需进一步分离纯化。在各种分离方法中，由于近年来发展起来的大孔吸附树脂吸附洗脱法具有选择性好、吸附容量大、再生处理方便，及吸附迅速、解吸容易等优点，在天然产物工业化提取分离中得到广泛应用。本文以葡萄籽为原料从中提取原花青素，并选用大孔吸附树脂对自制的原花青素进一步吸附、洗脱分离，进行纯化，就纯化后的原花青素产品在不同体系中**自由基的活性进行研究，探索提取高纯度原花青素的方法，为进一步开发利用原花青素提供参考。
1 实验材料
1.1 实验仪器
waters公司高压液相色谱仪，hhs型电热恒温水浴锅，shz-82水浴恒温振荡器，uv-2100紫外／可见分光光度仪，zfq-85a旋转蒸发仪，td5a-ws台式低速离心机。
1.2 实验材料
ab-8、ads-8和s-8型大孔树脂；原花青素标准品（浓度≥95％），购自天津尖峰天然产物有限公司；葡萄籽是新疆葡萄酒厂下脚料；亚油酸（不含抗氧化剂，含量≥90％）由本实验室用红花油提取；工业级乙醇、tris（三羟甲基氨基甲烷）及所用其他化学试剂均为分析纯。
2 实验方法
2.1 葡萄籽原花青素粗提方法
称取10.000g经石油醚脱脂葡萄籽粉（40目），用体积分数70％的乙醇溶液搅拌提取3次，合并提取液，离心过滤，得澄清的滤液。滤液在40℃以下减压浓缩，经真空干燥，得葡萄籽原花青素粗提物。此样品用于静态吸附及解吸性能试验。
2.2 原花青素含量分析方法
采用盐酸—香草醛法［5，6］，以原花青素标准品作标准曲线，计算样品中原花青素含量。
2.3 大孔树脂筛选
2.3.1 静态吸附量及解吸率的测定
准确称取吸附树脂2g，用少量乙醇湿润后，以蒸馏水洗去乙醇，再吸干其表面水分后置于150ml三角瓶中，加入40ml原花青素溶液（15mg／ml），置于水浴摇床，30℃，120r／min振荡36h后过滤，再用100ml95％乙醇洗脱树脂，分别测定滤液及洗脱液中原花青素总量，计算树脂的吸附量及解吸率。
2.3.2 ads-8树脂的吸附流出曲线与解吸曲线的绘制
处理后的ads-8树脂于水中湿法装柱，玻璃柱 ｏ11.9×42cm，其中树脂装填高度32cm，床体积约90ml。将葡萄籽原花青素粗提物用水稀释至原花青素浓度分别为5.8、15.0mg／ml，以2ml／min流速上样分步收集流出液（10ml／管），测定其中原花青素浓度。以流出液体积（bv）为横坐标、流出液中原花青素浓度c与进样原花青素浓度c0之比（c／c0）为纵坐标，绘制吸附透过曲线。
当流出液中原花青素浓度达进样浓度的1／10时认为已达到吸附的穿透点，停止进样，计算吸附通量。达吸附通量后的树脂，先以4bv去离子水洗柱，后用一定浓度的乙醇解吸，流速2ml／min，分步收集洗脱液，测定其中原花青素浓度，以洗脱液体积（bv）为横坐标、洗脱液中原花青素浓度（mg／ml）为纵坐标，绘制解吸曲线。
2.4 葡萄籽原花青素的层析纯化及分级提取
用体积分数10％、20％、40％、50％、70％的乙醇溶液进行解吸，流速2bv／h，洗脱体积3bv。将洗脱液真空浓缩，得到葡萄籽原花青素纯化物浓缩液。
2.5 研究葡萄籽原花青素**自由基活性的方法
2.5.1 **o2-·自由基试验
在试管1中加入2.8ml tris-hcl溶液、0.1ml水和0.1ml的0.01 mol hcl，在试管2中加入2.8mltris.hcl溶液、0.1ml 0.01molhcl，在试管3中加入2.8mltris－hcl溶液、0.1ml水，在试管4中加入2.8mltris-hcl溶液，将试管1～4、邻苯三酚溶液、2.4中提取原花青素溶液于25℃保温20min。然后以试管1作为参比，取0.1ml原花青素溶液加入到试管2中，迅速摇匀，420nm处测量吸光值a1；取0.1ml邻苯三酚溶液加入到试管3中，迅速摇匀，每隔30s测一次420nm处吸光值a2；分别取0.1ml原花青素溶液和0.1m1邻苯三酚溶液加入到试管4中，迅速摇匀，每隔30s测一次420nm处吸光值a3。按下式计算各样品对o2-·的**率i（％）。
2.5.2 原花青素对亚油酸体系抗氧化能力的检测——硫氰酸铁法（ftc法）
取1ml已溶解于无水乙醇的样品溶液，加入1ml含2.51％（v／v）亚油酸的无水乙醇溶液，2ml0.05m、ph7.0的磷酸盐缓冲液，1ml蒸馏水，密封后40℃恒温避光氧化，以乙醇代替抗氧化剂做空白对照。
过氧化值的测定采用硫氰酸铁法：取0.1ml亚油酸乳化液，依次加入9.7ml 75％的乙醇和0.1ml30％的硫氰酸氨，再加入0.1ml0.02m溶解于3.5％盐酸的氯化亚铁，快速混匀，反应3min后测定500nm吸光度，以a500nm表示亚油酸氧化程度，0时刻测定，以后每隔24h测定一次，扣除0时刻值即为t时刻过氧化值。各样品的抗氧化能力以192h时的氧化程度按下式计算，以抑制率（％）表示：
3 结果与分析
3.1 三种大孔吸附树脂对原花青素静态吸附及解吸性能比较
由表1中吸附量看，ab-8、ads-8和s-8型树脂均对原花青素具有相对较强的吸附能力。但从解吸效果来看，s-8树脂对原花青素的解吸回收率很低，很难再洗脱下来。而ads-8树脂不仅对原花青素吸附量高、解吸率高，对原花青素的选择性较强而且能够较容易地解吸下来。所以，从吸附与解吸特性综合衡量，ads-8树脂优于其它二种吸附树脂，是分离葡萄籽原花青素较理想的吸附剂，可用于原花青素的层析分离。
图1显示，浓度分别为5.8、15.0mg／ml的原花青素水溶液通过ads-8树脂时，吸附通量分别为8.7、3.9bv，即ads-8树脂对原花青素吸附量分别为53、58.5mg／g树脂，表明一定范围内原花青素的进样浓度越高，树脂的吸附量越大。
表1 三种大孔吸附树脂对原花青素静态吸附量及解吸率
树脂 吸附量（mg/g树脂） 解吸率（%）
ads-8 101 96.7
ab-8 89 96.3
s-8 126 29.4
3.2 ads-8树脂的解吸特性
用不同浓度的乙醇溶液梯度洗脱ads-8树脂吸附的原花青素时，原花青素解吸曲线均出现明显的峰值（图2），而且峰形比较集中，说明不同浓度的乙醇对原花青素的洗脱具有选择性，即一定浓度的乙醇能够选择性地洗脱具有相近性质的原花青素。在2ml／min的流速下，4bv40％树脂吸附的原花青素被洗脱时，一些非黄烷三醇类杂质在此乙醇浓度下不会被洗脱，从而可以选择性地洗脱得到高含量的原花青素［7］，其洗脱峰形也比较集中，4～5bv也基本可以洗脱此乙醇浓度下所能洗脱的原花青素。经ads-8大孔树脂层析分离，原花青素的纯度可达95％。
3.3 原花青素的梯度洗脱效果
从表2看，50％的乙醇可以较完全地将吸附在ads-8树脂上的原花青素解吸下来，这在工业生产中是可行的。70％的乙醇已经基本能够洗脱吸附于树脂上的绝大部分固形物，可以用于树脂柱的初步再生。这充分证明了树脂法分离原花青素时简单、高效的特点。
表2 不同浓度乙醇对ads-8树脂吸附原花青素的解吸率
乙醇浓度（%） 解吸率（%）
10 5.5
20 76.9
40 90.6
50 97.5
70 97.8
3.4 纯化的原花青素**超氧阴离子自由基o2·能力
从图3看出，原花青素粗提取物经ads-8大孔树脂层析分离，不同浓度乙醇溶液洗脱得到的纯化原花青素**超氧阴离子自由基o2·的能力不同，20％乙醇洗脱液抗氧化活性*强。当原花青素质量浓度达到10mg／ml时，**率达到88.35％，说明葡萄籽原花青素为抗自由基的有效活性成分。
3.5 原花青素对亚油酸体系的抗氧化能力
亚油酸乳化体系是用以检验抗氧化剂在食品体系中抗氧化作用的*常用的体系。图4是高聚和低聚原花青素对亚油酸体系氧化抑制率（原花青素抗氧化性）分别为93.04％和76.88％，而同浓度的vc及ve抑制率分别为35.52％和64.28％。在所研究的两种聚合度下原花青素抗氧化效果低于bht，但与空白对照相比，10μg／ml浓度时原花青素对亚油酸乳化体系的抗氧化效果已很明显，而且其抗氧化效果在一定范围内随浓度的增加而增强，在实际应用中可以通过适当增加其添加量而达到与bht相近的抗氧化效果。
4 结论
（1）ads-8大孔树脂对葡萄籽原花青素具有较强的吸附能力，得到的产物纯度高，是分离葡萄籽原花青素较理想的吸附剂。
（2）不同浓度的乙醇对原花青素的洗脱具有选择性，即一定浓度的乙醇能够选择性地洗脱具有相近性质的原花青素，能够分离出生物活性*强的部分低聚原花青素，乙醇溶液是较好的原花青素洗脱液。
（3）20％和40％的乙醇原花青素洗脱液具有很强的**o2·的能力，抑制邻苯三酚自氧化率分别达88.35％和67.2％。说明葡萄籽原花青素为抗自由基的有效活性成分。
（4）在亚油酸体系中，原花青素的抗氧化能力高于vc和ve。相同质量浓度时，二聚体的抗氧化性能*强，opc’s的抗氧化性随添加量增加而增加。◇
参考文献
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［4］崔介君，孙培龙，马新.原花青素的研究进展.食品科技，2003，2:92-95.
［5］broadhurst，r.b.jones.w.t analysis of condensed tanning usingacidified vanillin j.sci.food agric，1978，29（9）：788-796.
［6］孙芸，谷文英.硫酸-香草醛法测定葡萄籽原花青素含量.食品与发酵工业，2003，29（9）：43-45.
*基金项目：新疆维吾尔自治区重点科技攻关项目（2001ba507a04-p02）。
作者简介：朱靖蓉（1972～ ），女，新疆乌鲁木齐人，实验师，硕士研究生，研究方向为食品活性成分。